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        【干貨】一文了解vero細(xì)胞培養(yǎng)全流程

         更新時間:2023-10-08 點擊量:1126


        Vero細(xì)胞系是連續(xù)非整倍體細(xì)胞,連續(xù)細(xì)胞系可以經(jīng)過多次分裂而不衰老,非整倍體是指細(xì)胞中的染色體數(shù)目與通常的不同。與其它普通哺乳動物細(xì)胞不同,Vero細(xì)胞還有干擾素分泌缺陷的特點,當(dāng)被病毒感染時,它不能分泌干擾素,但它仍然具有α/β-干擾素的受體,所以對于其它來源的干擾素仍有正常的反應(yīng)。

        一、基本信息

        細(xì)胞名稱:Vero非洲綠猴腎細(xì)胞

        細(xì)胞別稱:VERO; Verda reno

        細(xì)胞形態(tài):上皮細(xì)胞樣

        生長特性:貼壁生長

        組織來源:正常腎

        培養(yǎng)基:MEM+10%FBS+1%PS

        生長條件:

        氣相:95%空氣+5%二氧化碳;

        溫度:37℃

        傳代方法:1:21:3,每周2-3次。

        二、培養(yǎng)指南

        1. Vero細(xì)胞復(fù)蘇步驟

        (1)1mL Vero細(xì)胞懸液凍存管于37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基進(jìn)行混合均勻;

        (2)1000rpm條件下離心4min,棄上清液,再加入1-2mL培養(yǎng)基后輕輕吹打混勻;

        (3)Vero細(xì)胞懸液加入到含有適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入到6cm皿中,加入約4mL的培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜);

        (4)第二天換液并觀察Vero細(xì)胞密度。

        2. Vero細(xì)胞傳代步驟

        Vero細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

        (1)1mL Vero猴腎細(xì)胞懸液凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍,加入4mL培養(yǎng)基混合均勻;

        (2)1000rpm條件下離心4min,棄上清液,再加入1-2mL培養(yǎng)基后吹打混勻;

        (3)Vero猴腎細(xì)胞胞懸液加入到含適量培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜(或?qū)⒓?xì)胞懸液加入到6cm皿中,加入約4mL培養(yǎng)基,培養(yǎng)過夜);

        (4)第二天換液并觀察Vero細(xì)胞密度。

        3. Vero細(xì)胞凍存步驟

        Vero細(xì)胞生長狀態(tài)良好,可進(jìn)行細(xì)胞凍存。以T25瓶為例:

        (1)收集Vero細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液,裝入無菌離心管中,于1000rpm條件下離心4min,棄上清液,用PBS清洗一遍,棄掉PBS后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

        (2)根據(jù)Vero細(xì)胞數(shù)量對應(yīng)加入無血清細(xì)胞凍存液,使細(xì)胞密度在5×106~1×107/mL之間,輕輕混勻,每支凍存管凍存1mL細(xì)胞懸液,注意凍存管上做好標(biāo)識。

        (3)將凍存管放入-80℃冰箱中,24h后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。

        三、注意事項

        1. 培養(yǎng)基不能回收使用

        灌液培養(yǎng)基不能再用來培養(yǎng)細(xì)胞,請換用按照說明書細(xì)胞培養(yǎng)條件新配制的wan全培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞。

        2. 細(xì)胞到貨處理說明

        (1)收到細(xì)胞后首先觀察細(xì)胞瓶是否完好,培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。

        (2)觀察好細(xì)胞狀態(tài)后,75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養(yǎng)箱放置2-4h

        (3)收到Vero細(xì)胞后第一次傳代建議1:2傳代,1:2傳代是指1T25瓶傳2T25瓶或者26cm皿,而不是1T25瓶傳210cm皿。

        四、常見問題

        1. vero細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)小黑點?

        處理方法:在細(xì)胞消化離心棄上清后,使用PBS重懸洗滌,在750rpm條件下低速離心4min,重新鋪下,然后鏡下觀察是否干凈。

        2. vero細(xì)胞生長過慢?

        (1)更換不同培養(yǎng)基或血清導(dǎo)致

        解決方法:分析新培養(yǎng)基與原培養(yǎng)基的成分,比較新血清與原血清支持細(xì)胞生長實驗,讓細(xì)胞逐漸適應(yīng)新培養(yǎng)基。

        (2)有少量細(xì)菌或真菌污染

        解決方法:用含抗生素培養(yǎng)液培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)污染,盡量丟棄培養(yǎng)物。

        (3)試劑保存不當(dāng)導(dǎo)致

        解決方法:血清需要保存在-10-20℃

        培養(yǎng)基需在2-8℃避光保存;

        含血清wan全培養(yǎng)液在2-8℃保存。

        (4)接種細(xì)胞起始濃度太低

        解決方法:增加接種細(xì)胞起始濃度。

        (5)細(xì)胞已老化

        解決方法:引入新的保種細(xì)胞,重新培養(yǎng)。

        (6)支原體污染

        解決方法:吸取部分培養(yǎng)基,離心得上清,檢測支原體;

        清潔支架和培養(yǎng)箱;

        可在培養(yǎng)皿里加入支原體去除劑清除;

        如發(fā)現(xiàn)支原體污染,建議盡量丟棄。

        3. vero細(xì)胞培養(yǎng)過程中不貼壁?

        (1)胰酶消化過度導(dǎo)致

        解決方法:嘗試縮短胰酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。

        (2)支原體污染

        解決方法:吸取培養(yǎng)2-3的培養(yǎng)基,檢測支原體;

        清潔支架和培養(yǎng)箱;

         如發(fā)現(xiàn)支原體污染,丟棄培養(yǎng)物。

        (3)培養(yǎng)基pH值過堿(NaHCO3分解)

        解決方法:使用無菌醋酸溶液調(diào)整pH值或充入無菌CO2

        (4)細(xì)胞老化

        解決方法:購買新的代數(shù)較低的細(xì)胞。

        (5)接種細(xì)胞起始濃度太低或太高

        解決方法:調(diào)節(jié)最佳接種細(xì)胞濃度。

        4. vero細(xì)胞用什么培養(yǎng)基?

        vero細(xì)胞培養(yǎng)基:MEM+10%FBS+1%P/S

        5. vero細(xì)胞DMSO凍存比例?

        凍存液:90%血清,10%DMSO,現(xiàn)用現(xiàn)配或無血清細(xì)胞凍存液。

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