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細(xì)胞轉(zhuǎn)染常用的轉(zhuǎn)染試劑很多，其中，Lipo3000深受廣大科研工作者的喜愛，那我們來看看Lipo3000細(xì)胞轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)吧！
一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
Lipofectamine™ 3000 轉(zhuǎn)染試劑（Thermo Fisher）、Opti-MEM（可以用無血清的培養(yǎng)基代替）
二、實(shí)驗(yàn)步驟
1.接種細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到70–90% 匯合度。
注：對(duì)于HEK293，6孔板一般鋪50萬個(gè)細(xì)胞左右。對(duì)于PC9, 24孔板一般鋪5-10萬個(gè)細(xì)胞。由于不同細(xì)胞，生長(zhǎng)狀況不太一樣，需要根據(jù)情況調(diào)整。
2. 使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine™ 3000 試 劑，充分混勻。
3.使用Opti-MEM™培養(yǎng)基稀釋DNA，制備 DNA 預(yù)混液，然后添加P3000™ 試劑，充分混勻。
4.將上面兩步溶液合在一起，混勻并孵育10-15mins。
5.將混勻后的溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，并輕輕搖晃培養(yǎng)基，使其均勻。
6.37°C 孵育細(xì)胞 2–4 天，然后分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
轉(zhuǎn)染量：
組分 | 96孔 | 24孔 | 6孔 |
DNA/孔 | 100ng | 500ng | 2500ng |
P3000TM/孔 | 0.2μL | 1μL | 5μL |
Lipofectamine™ 3000/孔 | 0.15和0.3μL | 0.75和1.5μL | 3.75和7.5μL |
三、注意事項(xiàng)
1.Opti-MEM需要37℃水浴鍋預(yù)熱。
2.轉(zhuǎn)染 siRNA 至細(xì)胞時(shí)，在稀釋 siRNA 時(shí)不要加入 P3000™ 試劑。
3.關(guān)于Lipo3000的用量，比如6孔板推薦用量有兩個(gè)3.75ul和7.5ul，最di看轉(zhuǎn)染xiao率，最高看細(xì)胞耐受。
4. Opti-MEM與Lipo3000預(yù)混及Opti-MEM、質(zhì)粒及P3000預(yù)混，都不需要各自孵育，而且兩者混合后孵育時(shí)間最多不要超過15mins。
5.轉(zhuǎn)染中和轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)基中最好不要含有雙抗。
對(duì)于比較好轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，如HEK293，而且需要大量轉(zhuǎn)染的時(shí)候，可以使用PEI進(jìn)行轉(zhuǎn)染，畢竟Lipo3000比較貴。例如，在做CO-IP實(shí)驗(yàn)時(shí)，需要10cm皿轉(zhuǎn)染好幾種質(zhì)粒，就可以用PEI進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。CO-IP步驟見免疫共沉淀Co-IP實(shí)驗(yàn)步驟。
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